核酸的性质及研究方法

不要把这五条当成五组孤立的知识点去背。每一条性质后面都挂着一类技术，而技术的细节（为什么用 260 nm、为什么要缓慢冷却、为什么用 ddNTP）全部都由性质决定。把「性质 → 技术」的对应关系建立起来，记忆量会大幅减少。

课件明确定义里就有这一句。变性的本质是维持双螺旋的氢键与碱基堆积力被破坏，而磷酸二酯键骨架完好。这直接决定了变性是可逆的（见第 4 节复性）——因为一级结构没被破坏，只要条件恢复，互补单链就能重新配对。如果共价键断裂了，那就叫降解或水解，不是变性（见第 5 节）。这个区分是整章的枢纽。

「紫外吸收升高、密度升高、黏度降低」看似三个独立现象，其实全部来自双螺旋 → 单链线团这一个结构变化：碱基从堆积状态变为暴露状态（吸光升高）、结构从紧密变为松散（密度升高）、分子从刚性棒变为柔性线团（黏度降低）。抓住这一个变化，三条表征就能一起推出来。

凡是增强双链间相互作用的因素，都提高 Tm；凡是削弱它的，都降低 Tm。GC 含量高 → 氢键多 → Tm 高；离子强度高 → 静电排斥被屏蔽 → Tm 高；变性剂存在 → 竞争性破坏配对 → Tm 低；样品均一性好 → 转变集中 → 曲线陡（但不改变 Tm 本身）。用这一句可以复原全部四条。

这一点是理解复性的关键。如果迅速冷却（淬火），单链来不及找到互补序列就已各自「冻结」成随机构象，无法重新配对；缓慢降温给互补链留出搜索与配对的时间。这也解释了 PCR 中退火步骤的温度设定——它是一个受控的、有目的地让引物与模板配对的复性过程。

复性的速率取决于互补序列彼此相遇的概率。基因组的序列复杂度越高（重复序列越少），要找到互补链就越难，复性就越慢。因此把复性程度对 Cot（浓度 × 时间的乘积）作图，曲线的位置直接反映序列复杂度。

这也是为什么真核基因组会出现多相曲线：高度重复序列（如卫星 DNA）复性极快，在中度重复序列之后，单拷贝序列需要很长的 Cot 才能复性。这个实验在测序技术出现之前，是了解基因组组成的主要手段——它不需要知道序列，只需要测「复性有多快」。

酸水解会优先脱去嘌呤碱基，生成无嘌呤酸（apurinic acid，AP 位点）。这正是 DNA 损伤中「脱嘌呤」的化学基础，也是 Maxam-Gilbert 化学断裂法测序的原理来源之一（见第 7 节）——用酸处理可以让嘌呤碱基脱落，再在碱性条件下用哌啶切断骨架。

RNA 易被碱水解的根本原因是其核糖 2′ 位有游离羟基，可以在碱性条件下作为亲核试剂进攻自身的磷酸二酯键，形成 2′,3′-环磷酸中间体，进而水解。DNA 的脱氧核糖没有 2′-OH，因此无法进行这个分子内进攻，所以抗碱。这与第 7 章讨论的「RNA 为什么不适合做遗传物质」是同一个化学事实的两个侧面——2′-OH 既是 RNA 能折叠催化的原因，也是它不稳定的原因。

因为「用哪个酶」取决于实验目的。要做序列分析，需要内切酶把长链切成可读的片段；要删除末端磷酸防止自连，需要外切酶或磷酸酶；要把基因切下来再拼到载体上，需要限制性内切酶产生特定末端。每一个维度对应一个实验需求——这也是这一章把核酸酶放在「研究方法」而不是「结构」里的原因。

核酸在 260 nm 有最大吸收（来自碱基的共轭双键），而蛋白质在 280 nm 有最大吸收（主要来自芳香族氨基酸）。因此两者的比值就是核酸纯度指标：纯的 DNA 样品 A₂₆₀/A₂₈₀ 约 1.8，纯 RNA 约 2.0。比值偏低说明蛋白质污染，偏高说明可能有 RNA 残留或降解。

这个指标把两章的内容连起来了：260 nm 来自第 6 章的碱基结构，280 nm 来自第 2 章的芳香族氨基酸侧链。理解了各自的来源，就不必死记数值。

①「少量 ddNTP」的作用：如果 ddNTP 浓度高，链会在第一个位置就终止，只能得到一条带；只有让 ddNTP 以低概率随机掺入，才能在每个可能的位置都产生一部分终止的链，形成长度连续的一套片段。这是「末端终止法」能读出完整序列的数学前提。

② 为什么最终要转化：测序反应合成的是新链，而新链与模板链互补。所以电泳读出的是新链的序列，真正的待测序列是它的互补序列。这一步是初学者最容易漏掉的。

注意四个泳道是 G、A+G、C+T、C，而不是简单的 A/G/C/T 四组。原因是化学试剂很难做到对单一碱基的绝对专一：「A+G」与「C+T」是粗分，「G」与「C」是细分。通过比较泳道之间的差集才能确定每个位置的确切碱基——某位置若出现在「A+G」但不出现在「G」泳道，那就是 A。

高盐的作用是抑制肼对 T 的反应，从而把「C+T」变成只切 C。这是化学选择性的一个典型技巧：用反应条件而不是新试剂来实现专一性。

对比两种方法：Sanger 法靠酶（聚合酶 + ddNTP），Maxam-Gilbert 法靠化学试剂。后者需要放射性标记且操作繁琐、试剂有毒，因此在自动化竞争中落败，但它的原理（特定碱基修饰 → 骨架切割 → 电泳读出）在 DNA 足迹分析等领域仍在使用。

这是它相对于 Sanger 法的独特优势。因为峰值高度正比于掺入的核苷酸数目，如果模板上有连续的 TTTT，一次加入 dTTP 就会有四个核苷酸同时掺入，产生一个四倍高的峰。所以焦磷酸测序不仅能读序列，还能直接读出同聚物（homopolymer）的长度。

代价是：同聚物过长时（通常超过 5–6 个），峰高与数目的线性关系会变差，容易读错长度——这是 454 测序平台的主要错误来源。这也解释了为什么后来发展的 Illumina 等平台采用了完全不同的「可逆终止 + 荧光成像」策略。

第一代（Sanger、Maxam-Gilbert）：准确度极高，是「金标准」，但通量低、成本高，一次只能读一条序列。

第二代（焦磷酸测序、Ion Torrent、Illumina）：核心突破是大规模并行——把测序反应分散到数百万个微小反应单元中同时进行。课件提到的深度测序（deep sequencing）正是建立在此基础上：高通量测序技术可以对数百万个 DNA 分子同时进行测序，操作极为简便，大大节约了成本和时间，使得对一个物种基因组和转录组进行细致全面的分析成为可能。

第三代（纳米孔、单分子测序）：核心突破是长读长与单分子——不需要扩增，直接读单个分子，读长可达数十 kb，能够解决重复序列、结构变异等问题。

因为 Sanger 法依赖 DNA 聚合酶，而 DNA 聚合酶不能以 RNA 为模板。逆转录酶恰好能做到这一点，于是把 RNA 问题转化成 DNA 问题——这是「把不熟悉的体系转化为熟悉的体系」这一方法学思想的典型例子。

这也解释了为什么 RNA 测序在历史上远晚于 DNA 测序，以及为什么转录组研究要依赖逆转录（今天的 RNA-seq 依然如此：逆转录 → 建库 → 高通量测序）。

本次测验的概念校正：去除末端磷酸通常用磷酸酶；Sanger读出的是新链。焦磷酸测序中模板T对应掺入A，必须区分模板与新链。紫外纯度比值正常不能单独证明无污染或完整无降解。